O que é o microARN31 e como pode ser importante numa terapia para Alzheimer

Identificada como uma prioridade de saúde pública pela Organização Mundial da Saúde (OMS), a demência afeta cerca de 50 milhões de pessoas em todo o mundo e tem um custo social global estimado em 818 mil milhões de dólares anuais pela própria OMS - o equivalente a 1,1% do produto interno bruto mundial. E a tendência é de um aumento galopante em curso, potenciado pelo progressivo envelhecimento da população mundial. Embora existam muitas formas diferentes de demência, a doença de Alzheimer é, de longe, a mais comum, atingindo 60% a 70% dos casos. E apesar de este ser um dos principais focos de atenção dos cientistas atualmente, uma cura ou um tratamento eficaz parecem ainda longe do horizonte.

Há, no entanto, sinais de esperança que vão saindo dos laboratórios de investigação. E um deles chega-nos do Centro de Neurociências e Biologia Celular (CNC) da Universidade de Coimbra, onde a investigadora Ana Luísa Cardoso e a sua equipa identificaram uma potencial nova via terapêutica para o combate à doença de Alzheimer, ao descobrir uma molécula microARN que consegue regular (no caso, reduzir) a produção de duas proteínas sobre-expressas - ou seja, muito presentes - nos doentes de Alzheimer: a proteína precursora beta-amiloide (APP) e a beta-secretase (BACE1).

A doença de Alzheimer caracteriza-se pela progressiva degeneração e morte dos neurónios, especialmente na zona do hipocampo, a zona do cérebro onde se formam e consolidam as nossas memórias, o que faz que a perda de memória seja o seu sintoma mais marcante. A investigação da equipa de Ana Luísa Cardoso permitiu descobrir o potencial do microARN31 na redução da perda de memória, em testes in vivo com ratinhos. O aumento da expressão deste microARN no hipocampo dos animais levou a uma diminuição da deposição de placas beta-amiloide, especialmente na zona do subículo - uma pequena área do hipocampo responsável pela memória de trabalho. Ora, as placas beta-amiloide são aglomerados tóxicos de peptídeos (pequenos pedaços) da proteína APP e são consideradas um dos marcadores mais importantes da doença, pelo que a sua regulação através da ação do miARN31 pode ser um avanço importante na descoberta de melhores formas de intervenção sobre a patologia.

"Notámos que, comparando com os animais do grupo de controlo (não tratados), os que receberam o microARN31 apresentavam menores défices de memória de trabalho do que aqueles que não o receberam. Estamos a falar do tipo de memória que é recrutada em tarefas simples do dia-a-dia, não implicando vários processos de aprendizagem. Além disso, estes animais tratados apresentavam menores níveis de ansiedade e de inflexibilidade cognitiva - características presentes em fases iniciais da doença", refere Ana Luísa Cardoso.

Os microARN são, como o próprio nome indica, "ARN mais pequenos", um tipo de moléculas que constitui uma descoberta relativamente recente no domínio das ciências. Se o ARN mensageiro é um tipo de ácido nucleico primo do ADN que tem por função copiar uma sequência desse ADN, transportá-la para fora do núcleo da célula e usá-la para a produção de todas as proteínas que nos permitem respirar, pensar, mexer, viver, já os microARN "têm também uma função de regulação genética", explica a investigadora. "O que eles fazem, na verdade, não é produzir proteínas, mas regular essa produção", acrescenta. "Eles fazem uma regulação fina das proteínas. No momento em que uma proteína está a ser produzida em grande quantidade, por exemplo, bloqueiam a sua produção. E como é que eles fazem isso? Ligam-se ao ARN mensageiro que traz as informações presentes no nosso código genético necessárias à produção dessa proteína e podem promover a sua degradação completa ou inibir a sua utilização por parte da célula provisoriamente", descreve Ana Luísa Cardoso.

Não se sabe ainda exatamente quantos miARN (o diminutivo usado para designar estes microARN) distintos existem no genoma humano, mas estima-se que esse número supere um milhar. E apesar de a biologia destas moléculas ainda não ser totalmente conhecida, a expressão anómala destes minúsculos ARN tem sido associada a diferentes patologias, das doenças neurodegenerativas ao cancro, por exemplo. A polivalência destes miARN, com capacidade para se adaptarem a diferentes alvos (ARN mensageiros), parece ser uma das suas potencialidades mais interessantes. "Eles não precisam de ter uma complementaridade perfeita para poderem atuar. Podem só ligar-se em determinados pontos, o que faz que tenham um espectro mais amplo de atuação", sustenta Ana Luísa Cardoso. Foi essa capacidade também que levou esta equipa do Centro de Neurociências e Biologia Celular da Universidade de Coimbra a optar por este miARN31.

Citaçãocitacao"Os microARN fazem uma regulação fina das proteínas. Quando uma proteína está a ser produzida em grande quantidade, por exemplo, bloqueiam a sua produção."

O processo começou com a escolha de "duas proteínas que são muito importantes na doença", que são a proteína precursora beta-amiloide (APP) - "que na verdade é a que dá origem ao peptídeo que depois se deposita no cérebro dos pacientes" - e uma outra que é a beta-secretase (BACE1) - "que está envolvida na produção desse peptídeo: pega na proteína beta-amiloide, cliva-a em determinados sítios e dá origem a um peptídeo insolúvel, que é o tal que se deposita no cérebro dos doentes". Depois, foram à procura de miARN com potencial para se ligarem aos ARN mensageiros das duas proteínas. De uma pré-escolha de cinco, o miARN31 emergiu como o mais promissor. "Porquê? Porque ele era capaz de simultaneamente ter efeitos tanto na proteína beta-amiloide como na beta-secretase, reduzindo os níveis celulares de ambas as proteínas. E assim não precisávamos de dois diferentes."

O que está descrito num dos mecanismos associados à doença de Alzheimer - a teoria amiloidogénica - é que um dos motivos por detrás da doença é o excesso de deposição destes peptídeos beta-amiloides. Ou seja, é como se vários detritos de sujidade se fossem acumulando junto aos neurónios formando uma grande placa de lixo que impede a normal função e comunicação neuronal.

Estes peptídeos, "não só as placas em si mas os oligómeros, que são um estado anterior dessas placas (com menos resíduos de peptídeo), interferem na capacidade de os neurónios comunicarem entre eles, transmitirem o impulso nervoso, e eventualmente provocam degeneração dos neurónios, acabando por levar à morte neuronal a longo prazo". A perda de neurónios é o que acaba por levar aos sintomas da doença e eventualmente à morte das pessoas. "Mas tudo começa com estes eventos a nível molecular e celular de clivagem desta proteína e produção deste peptídeo", frisa a cientista.

O que se verifica nas células doentes, em pacientes de Alzheimer, é que há uma falha deste miARN31. "No caso deste miARN estava já descrito num artigo que nos doentes de Alzheimer ele se encontra diminuído a nível sistémico. O que nós acreditámos, e acabámos por comprovar no modelo animal, é que ele estava diminuído também no tecido cerebral. Portanto, aumentá-lo para os níveis normais seria benéfico, pois favoreceria a sua ligação ao ARN mensageiro dessas duas proteínas, contribuindo para suspender, temporária ou definitivamente, a tal produção excessiva", diz Ana Luísa Cardoso.

Os ensaios pré-clínicos in vivo recorreram a ratinhos e verificaram então que os animais que receberam microARN31 apresentaram menores défices de memória de trabalho. "Temos vários tipos de memória e isso é uma coisa que se percebe muito bem nos doentes de Alzheimer. Por exemplo, muitos são capazes de se lembrarem perfeitamente de coisas que aconteceram na infância e não se lembram de coisas que aconteceram ontem. Temos a memória a curto prazo, que é a que nos permite decorar rapidamente um número de telefone, por exemplo; temos a memória de trabalho, que é a que nos permite, numa situação de horas, ou no cumprimento de uma determinada tarefa, seguir uma rotina de processos; e depois temos uma memória de longo prazo, que nos permite lembrar das experiências boas e más que aconteceram ao longo da nossa vida. E existem testes de comportamento que nos permitem avaliar estes diferentes tipos de memória nos animais", explica.

Citaçãocitacao"Os animais tratados apresentaram menores níveis de ansiedade e de inflexibilidade cognitiva, características presentes em fases iniciais da doença."

E como foi testada essa memória nos ratinhos? "Por exemplo, o que fazemos para testar a memória de curto prazo e a memória de trabalho é colocar os animais numa arena em forma de T, em que os animais estão na base do T e têm de chegar ao fim desse segmento e escolher entre a esquerda e a direita", descreve. "Os animais normais, que não tenham nenhuma patologia, tendem a alternar essa escolha. Dizemos que têm uma percentagem de alternância elevada, porque conseguem lembrar-se de onde foram anteriormente e alternam. O que acontece quando há problemas nesta memória é que estes procedimentos de recordação e escolha ficam comprometidos. Como não se lembram do caminho que já percorreram, tendem a ir mais vezes para o mesmo lado. Em vez de alternarem 80% das vezes, tendem a ter movimentos mais repetitivos."

Já para testar a memória de longo prazo existem outros testes mais complexos, que implicam treinar o animal durante alguns dias. "Num destes testes, os ratinhos são colocados numa arena que é basicamente uma mesa redonda com 12 buracos e em que por baixo de um desses buraquinhos há uma caixa preta. Nos primeiros dias de teste ensinamos ao animal onde está a caixa e eles aprendem o caminho até essa caixa. Fazemos isto vários dias até que chega um momento em que tiramos essa caixa do sítio. Depois de modificarmos as condições, colocamos o animal na arena novamente, para ver se ele se lembra onde é que a caixa se encontrava. E, uma vez o animal verificando que a caixa não se encontra no mesmo local, analisamos o que faz a seguir, se procura a caixa noutro sítio ou não, e qual a estratégia que usa para a procurar", conta Ana Luísa Cardoso. A conclusão verificada, nos animais modificados geneticamente para apresentarem sintomas de Alzheimer, "foi que eles até se lembravam, embora menos do que os do grupo de controlo, onde é que estava a caixa originalmente, mas quando lá chegavam e não a encontravam não saíam de lá, não apresentavam uma estratégia para ir encontrar a caixa noutro buraco e nunca atravessavam a arena porque estavam muito mais ansiosos do que o grupo controlo", refere a investigadora do CNC.

Estes sinais de inflexibilidade cognitiva e de grande ansiedade são sintomas que têm paralelismo com aquilo que acontece na doença de Alzheimer nos humanos. "A inflexibilidade cognitiva é um dos primeiros sintomas nos doentes e que muitas vezes é desvalorizado. Muitas vezes costumamos dizer que as pessoas, com a idade, ficam teimosas. As pessoas com Alzheimer ficam ainda mais teimosas. Nota-se por exemplo na incapacidade de adaptação a novas rotinas ou cenários. As coisas têm de ser feitas exatamente daquela maneira e se mudarmos um bocadinho as condições ou as rotinas da pessoa, ela fica a sentir-se completamente desorientada. E isto é um sintoma muito precoce de Alzheimer", aponta Ana Luísa Cardoso. "Tal como outros eventos, que podem ocorrer ainda numa fase precoce da doença, como por exemplo quando a pessoa sai à rua e de repente não sabe onde é que está e se sente perdida. "O que é que eu estou aqui a fazer? Como é que vou para casa?" Existe uma desorientação espacial e uma incapacidade para adaptar."

Citaçãocitacao"O que nós acreditámos, e acabámos por comprovar no modelo animal, é que este miARN31 estava diminuído também no tecido cerebral dos doentes de Alzheimer."

O que a entrega do miARN31 demonstrou, neste estudo publicado na revista científica Molecular Therapy - Nucleic Acids, foi que os animais passavam a comportar-se de forma mais próxima à do grupo controlo (os "saudáveis"). "A taxa de alternância, no teste de memória de curto prazo e memória de trabalho, melhorou drasticamente. No teste de memória longa, os animais também se mostraram menos ansiosos e a inflexibilidade cognitiva parece ser em parte ultrapassada também com esta terapia."

Uma das principais fases deste estudo focou-se no desenvolvimento de uma estratégia lentiviral, ou seja, uma ferramenta de expressão de um vírus capaz de entregar este miARN31 aos neurónios e possível de ser entregue no cérebro do modelo animal. "Os microARN são ácidos nucleicos, eles não entram nas células, não atravessam simplesmente as membranas celulares. É preciso arranjar uma forma eficiente de os entregar. Esta é a grande barreira da terapia génica, sempre foi, que apenas pode ser ultrapassada se encontrarmos um veículo que transporte estes ácidos nucleicos para dentro das células. Quando falamos de neurónios este problema torna-se ainda mais delicado, porque os neurónios, por não se dividirem (como acontece com outro tipo de células do nosso organismo) e por estarem tão protegidos dentro do nosso cérebro, um órgão tão bem isolado do resto do organismo, acabam por precisar de um veículo de entrega ainda mais eficaz. E aí vamos utilizar veículos que existem na natureza e que nós sabemos que tiveram milhares de anos de evolução e já são muito bons a entregar esses ácidos nucleicos, que são os vírus", explica a investigadora. Ora, os lentivírus "têm uma propriedade interessante que os torna muito bons para induzir a entrega de material genético ao cérebro porque a sua cápsula, o seu invólucro, em alguns tipos de lentivírus, é específico para neurónios", acrescenta Ana Luísa Cardoso.

A equipa do CNC da Universidade de Coimbra também optou por utilizar apenas ratinhos fêmeas neste estudo, uma afirmação perante o "machismo" dominante nos testes in vivo. "Isto é uma daquelas coisas instituídas na ciência e que agora estamos a tentar mudar. Normalmente os testes são feitos em ratinhos machos porque quando fazemos testes comportamentais em fêmeas temos de entrar em conta com os ciclos de fertilidade, pois a produção hormonal pode alterar significativamente o comportamento. E para alguns testes isso é algo crítico. No entanto, não faz sentido excluir os animais fêmeas dos estudos, sobretudo quando estamos a falar de doenças em que as mulheres são uma população significativamente afetada", justifica.

Natural de Coimbra, com um ADN familiar ligado às ciências na cidade - pai médico, mãe engenheira química, uma tia farmacêutica, a irmã também seguiu medicina -, Ana Luísa Cardoso cedo teve a certeza de que o seu percurso iria seguir o trilho das ciências e da Universidade de Coimbra, onde cursou Bioquímica. Fez doutoramento em Munique, na Alemanha, onde já estudava terapia genética do sistema nervoso central e quando terminou o doutoramento percebeu que "o que queria mesmo era estudar o sistema neuroimune". O estudo das moléculas microARN veio no seguimento do trabalho de doutoramento. "Dediquei-me a elas no pós-doc", conta a investigadora, que espera ver esta descoberta sobre as potencialidades do miARN31 contribuir para desvendar um pouco mais sobre uma doença, o Alzheimer, que se apresenta como um dos principais desafios atuais para a ciência.

Desde logo porque uma das principais e primeiras dificuldades está em classificar a doença de Alzheimer quanto às suas causas. "Não podemos dizer que é uma doença genética pura, não é. Na doença de Alzheimer, o número de casos atribuídos definitivamente a causas genéticas, a mutações, é ínfimo. Podemos dizer que existem fatores genéticos capazes de aumentar o risco da doença, embora não seja taxativo que isso ocorra, e certamente também existem fatores ambientais a contribuir. Aliás, nós sabemos que infeções em determinadas faixas etárias das pessoas mais idosas, como gripes, infeções virais, saúde oral, tudo o que leva a um aumento de inflamação sistémica e cerebral, pode agravar a doença, fazer que ela se desenrole muito mais rapidamente", explica a investigadora.

Citaçãocitacao"Tenho de ser realista. De uma cura completa e eficaz acho que estamos bastante longe. Não podemos curar uma doença da qual ainda não percebemos tudo."

Mas enquanto na área terapêutica não têm sido feitos grandes avanços nos últimos anos - surgiu neste ano nos EUA um fármaco, pela primeira vez nos últimos 20 anos -, na área do diagnóstico têm sido feitos muitos avanços. "Hoje em dia existem técnicas que nos permitem verificar a presença dos peptídeos muito mais cedo e em menor quantidade, permitem-nos ver alterações a nível inflamatório do sistema neuroimune, perceber se as células imunes que atuam a nível cerebral estão mais ativas do que seria de esperar. Por outro lado, toda a parte das alterações do sistema neuroimune descritas recentemente no contexto desta doença abre as portas a outro tipo de terapias, em que a ideia seja modelar a capacidade destas células em eliminar os peptídeos, por exemplo. Melhorar o processo de limpeza", refere Ana Luísa Cardoso.

Pequenas portas que se vão abrindo num gigantesco labirinto para o qual, admite, não se vislumbra uma saída no horizonte próximo. "Tenho de ser realista. Gostava de ser fonte de uma notícia mais animadora, mas para já não consigo. De uma cura completa e eficaz acho que estamos bastante longe. De uma capacidade de melhorar e atrasar a progressão da doença podemos estar mais perto, sim, aí já não sou tão pessimista. Mas curar... não podemos curar uma doença da qual ainda não percebemos tudo."

---

B.I.

Ana Luísa Cardoso
Licenciada em Bioquímica.
Investigadora do Centro de Neurociências e Biologia Celular da Universidade de Coimbra.
Com foco no sistema neuroimune, dedicou vários anos ao estudo do papel dos miARN nas doenças do sistema nervoso central.

rui.frias@dn.pt